вести

Во изминатата деценија, технологијата за секвенционирање на гени е широко користена во истражувањето на ракот и клиничката пракса, станувајќи важна алатка за откривање на молекуларните карактеристики на ракот. Напредокот во молекуларната дијагноза и целната терапија го промовираше развојот на концептите за прецизна терапија на тумори и донесе големи промени во целата област на дијагностицирање и лекување на тумори. Генетското тестирање може да се користи за предупредување од ризик од рак, насочување на одлуките за третман и евалуација на прогнозата, и е важна алатка за подобрување на клиничките исходи на пациентите. Овде, ги сумираме неодамнешните статии објавени во CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol и други списанија за да ја разгледаме примената на генетското тестирање во дијагностицирањето и лекувањето на ракот.

Соматски мутации и мутации на герминативната линија. Општо земено, ракот е предизвикан од мутации на ДНК кои можат да бидат наследени од родителите (мутации на герминативната линија) или стекнати со возраста (соматски мутации). Мутациите на герминативната линија се присутни од раѓање, а мутаторот обично ја носи мутацијата во ДНК на секоја клетка во телото и може да се пренесе на потомството. Соматските мутации се стекнуваат од поединци во негаметски клетки и обично не се пренесуваат на потомството. И герминативните и соматските мутации можат да ја уништат нормалната функционална активност на клетките и да доведат до малигна трансформација на клетките. Соматските мутации се клучен двигател на малигнитет и најпредвидлив биомаркер во онкологијата; сепак, приближно 10 до 20 проценти од пациентите со тумор носат мутации на герминативната линија кои значително го зголемуваат ризикот од рак, а некои од овие мутации се и терапевтски.
Двигателна мутација и патничка мутација. Не сите варијанти на ДНК влијаат на функцијата на клетките; во просек, потребни се пет до десет геномски настани, познати како „двигателни мутации“, за да се предизвика нормална дегенерација на клетките. Двигателните мутации често се јавуваат во гени тесно поврзани со животните активности на клетките, како што се гените вклучени во регулацијата на растот на клетките, поправката на ДНК, контролата на клеточниот циклус и други животни процеси, и имаат потенцијал да се користат како терапевтски цели. Сепак, вкупниот број на мутации кај кој било рак е доста голем, почнувајќи од неколку илјади кај некои видови на рак на дојка до повеќе од 100.000 кај некои многу варијабилни колоректални и ендометријални карциноми. Повеќето мутации немаат или имаат ограничено биолошко значење, дури и ако мутацијата се појави во кодирачкиот регион, таквите незначителни мутациски настани се нарекуваат „патнички мутации“. Ако генската варијанта во одреден тип на тумор го предвидува нејзиниот одговор или отпорност на третман, варијантата се смета за клинички операбилна.
Онкогени и гени за супресија на тумори. Гените кои често мутираат кај ракот можат грубо да се поделат во две категории, онкогени и гени за супресија на тумори. Во нормалните клетки, протеинот кодиран од онкогените главно игра улога во промовирање на клеточната пролиферација и инхибирање на клеточната апоптоза, додека протеинот кодиран од онкосупресорските гени е главно одговорен за негативно регулирање на клеточната делба за одржување на нормалната функција на клетките. Во процесот на малигна трансформација, геномската мутација води до зголемување на онкогенската активност и намалување или губење на активноста на онкосупресорските гени.
Мала варијација и структурна варијација. Ова се двата главни типа на мутации во геномот. Малите варијанти ја менуваат ДНК со менување, бришење или додавање на мал број бази, вклучувајќи вметнување на бази, бришење, поместување на рамката, старт губење на кодон, стоп губење на кодон мутации итн. Структурната варијација е големо преуредување на геномот, кое вклучува генски сегменти со големина од неколку илјади бази до поголемиот дел од хромозомот, вклучувајќи промени во бројот на копии на генот, бришење на хромозомот, дупликација, инверзија или транслокација. Овие мутации може да предизвикаат намалување или подобрување на функцијата на протеините. Покрај промените на ниво на поединечни гени, геномските потписи се исто така дел од извештаите за клиничко секвенционирање. Геномските потписи може да се видат како сложени модели на мали и/или структурни варијации, вклучувајќи оптоварување со туморски мутации (TMB), микросателитна нестабилност (MSI) и дефекти на хомологна рекомбинација.

Клонална мутација и субклонална мутација. Клоналните мутации се присутни во сите туморски клетки, се присутни при дијагнозата и остануваат присутни по напредувањето на третманот. Затоа, клонските мутации имаат потенцијал да се користат како терапевтски цели за тумор. Субклонските мутации се присутни само кај подгрупа на клетки на ракот и може да се детектираат на почетокот на дијагнозата, но исчезнуваат со последователна рекурентност или се појавуваат само по третманот. Хетерогеноста на ракот се однесува на присуството на повеќе субклонски мутации кај еден рак. Имено, огромното мнозинство од клинички значајните двигателски мутации кај сите вообичаени видови на рак се клонски мутации и остануваат стабилни во текот на прогресијата на ракот. Отпорноста, која често е посредувана од субклонови, може да не се открие во времето на дијагнозата, но се појавува кога ќе се рецидивира по третманот.

Традиционалната техника FISH или клеточен кариотип се користи за откривање на промени на хромозомско ниво. FISH може да се користи за откривање на генски фузии, делеции и амплификации и се смета за „златен стандард“ за откривање на такви варијанти, со висока точност и чувствителност, но ограничен проток. Кај некои хематолошки малигнитети, особено акутна леукемија, кариотипизацијата сè уште се користи за насочување на дијагнозата и прогнозата, но оваа техника постепено се заменува со целни молекуларни анализи како што се FISH, WGS и NGS.
Промените во поединечните гени може да се детектираат со PCR, и PCR во реално време и PCR со дигитален пад. Овие техники имаат висока чувствителност, се особено погодни за откривање и следење на мали резидуални лезии и можат да добијат резултати за релативно кратко време, недостаток е што опсегот на детекција е ограничен (обично откриваат само мутации кај еден или неколку гени), а можноста за повеќекратни тестови е ограничена.
Имунохистохемијата (IHC) е алатка за следење базирана на протеини која најчесто се користи за откривање на експресија на биомаркери како што се ERBB2 (HER2) и естрогенски рецептори. IHC може да се користи и за откривање на специфични мутирани протеини (како што е BRAF V600E) и специфични генски фузии (како што се ALK фузиите). Предноста на IHC е што лесно може да се интегрира во рутинскиот процес на анализа на ткивото, така што може да се комбинира со други тестови. Покрај тоа, IHC може да обезбеди информации за локализацијата на субцелуларните протеини. Недостатоците се ограничена скалабилност и високи организациски барања.
Секвенцирање од втора генерација (NGS) NGS користи техники на паралелно секвенцирање со висок проток за откривање на варијации на ниво на ДНК и/или РНК. Оваа техника може да се користи за секвенцирање и на целиот геном (WGS) и на генските региони од интерес. WGS обезбедува најсеопфатни информации за геномски мутации, но постојат многу пречки за неговата клиничка примена, вклучувајќи ја потребата од свежи примероци од туморско ткиво (WGS сè уште не е погоден за анализа на примероци имобилизирани со формалин) и високата цена.
Целното секвенционирање на NGS вклучува секвенционирање на целиот екзон и панел на целни гени. Овие тестови ги збогатуваат регионите од интерес со ДНК сонди или PCR амплификација, со што се ограничува количината на потребно секвенционирање (целиот екзом сочинува 1 до 2 проценти од геномот, а дури и големите панели што содржат 500 гени сочинуваат само 0,1 процент од геномот). Иако секвенционирањето на целиот екзон добро функционира во ткива фиксирани со формалин, неговата цена останува висока. Комбинациите на целни гени се релативно економични и овозможуваат флексибилност при изборот на гени што треба да се тестираат. Покрај тоа, циркулирачката слободна ДНК (cfDNA) се појавува како нова опција за геномска анализа на пациенти со рак, позната како течни биопсии. И клетките на ракот и нормалните клетки можат да ослободат ДНК во крвотокот, а ДНК-та што се исфрла од клетките на ракот се нарекува циркулирачка туморска ДНК (ctDNA), која може да се анализира за откривање на потенцијални мутации во туморските клетки.
Изборот на тест зависи од специфичниот клинички проблем што треба да се реши. Повеќето биомаркери поврзани со одобрени терапии може да се детектираат со FISH, IHC и PCR техники. Овие методи се разумни за детекција на мали количини на биомаркери, но тие не ја подобруваат ефикасноста на детекцијата со зголемување на протокот, а ако се детектираат премногу биомаркери, може да нема доволно ткиво за детекција. Кај некои специфични видови на рак, како што е ракот на белите дробови, каде што е тешко да се добијат примероци од ткиво и има повеќе биомаркери за тестирање, користењето на NGS е подобар избор. Како заклучок, изборот на анализа зависи од бројот на биомаркери што треба да се тестираат за секој пациент и бројот на пациенти што треба да се тестираат за биомаркерот. Во некои случаи, употребата на IHC/FISH е доволна, особено кога целта е идентификувана, како што е детекцијата на естрогенски рецептори, прогестеронски рецептори и ERBB2 кај пациенти со рак на дојка. Доколку е потребно поопсежно истражување на геномските мутации и потрагата по потенцијални терапевтски цели, NGS е поорганизиран и поекономичен. Дополнително, NGS може да се земе предвид во случаи кога резултатите од IHC/FISH се двосмислени или неубедливи.

Различни упатства даваат насоки за тоа кои пациенти треба да бидат подобни за генетско тестирање. Во 2020 година, Работната група за прецизна медицина на ESMO ги издаде првите препораки за тестирање на NGS за пациенти со напреднат рак, препорачувајќи рутинско тестирање на NGS за напреднат несквамозен неситноклеточен рак на белите дробови, рак на простата, колоректален рак, рак на жолчниот канал и примероци од тумори на рак на јајници, а во 2024 година, ESMO ажурираше врз основа на ова, препорачувајќи вклучување на рак на дојка и ретки тумори. Како што се гастроинтестинални стромални тумори, саркоми, рак на тироидната жлезда и ракови со непознато потекло.
Во 2022 година, Клиничкото мислење на ASCO за тестирање на соматскиот геном кај пациенти со метастатски или напреднат рак наведува дека ако терапија поврзана со биомаркери е одобрена кај пациенти со метастатски или напредни солидни тумори, за овие пациенти се препорачува генетско тестирање. На пример, геномско тестирање треба да се изврши кај пациенти со метастатски меланом за скрининг на BRAF V600E мутации, бидејќи RAF и MEK инхибиторите се одобрени за оваа индикација. Покрај тоа, генетското тестирање треба да се изврши и ако постои јасен маркер на отпорност за лекот што треба да се администрира на пациентот. На пример, Egfrmab е неефикасен кај KRAS мутантниот колоректален рак. Кога се разгледува соодветноста на пациентот за секвенционирање на гени, треба да се интегрираат физичката состојба на пациентот, коморбидитетите и стадиумот на туморот, бидејќи серијата чекори потребни за секвенционирање на геномот, вклучувајќи ја согласноста на пациентот, лабораториската обработка и анализата на резултатите од секвенционирањето, бараат пациентот да има соодветен физички капацитет и очекуван животен век.
Покрај соматските мутации, некои видови на рак треба да се тестираат и за гени на герминативната линија. Тестирањето за мутации на герминативната линија може да влијае на одлуките за третман на видови на рак како што се мутациите BRCA1 и BRCA2 кај рак на дојка, јајници, простата и панкреас. Мутациите на герминативната линија може да имаат импликации и за иден скрининг и превенција на рак кај пациенти. Пациентите кои се потенцијално погодни за тестирање за мутации на герминативната линија треба да исполнуваат одредени услови, кои вклучуваат фактори како што се семејна историја на рак, возраст при дијагноза и вид на рак. Сепак, многу пациенти (до 50%) кои носат патогени мутации во герминативната линија не ги исполнуваат традиционалните критериуми за тестирање за мутации на герминативната линија врз основа на семејната историја. Затоа, за да се максимизира идентификацијата на носителите на мутации, Националната сеопфатна мрежа за рак (NCCN) препорачува сите или повеќето пациенти со рак на дојка, јајници, ендометриум, панкреас, колоректален или простата да се тестираат за мутации на герминативната линија.
Во однос на времето на генетското тестирање, бидејќи огромното мнозинство од клинички значајните мутации-двигатели се клонални и релативно стабилни во текот на прогресијата на ракот, разумно е да се изврши генетско тестирање кај пациенти во времето на дијагностицирање на напреднат рак. За последователно генетско тестирање, особено по молекуларно насочена терапија, тестирањето на ctDNA е поповолно од ДНК од туморско ткиво, бидејќи ДНК од крв може да содржи ДНК од сите туморски лезии, што е поповолно за добивање информации за хетерогеноста на туморот.
Анализата на ctDNA по третманот може да биде во можност да го предвиди одговорот на туморот на третманот и да ја идентификува прогресијата на болеста порано од стандардните методи на снимање. Сепак, протоколите за користење на овие податоци за насочување на одлуките за третман не се утврдени, а анализата на ctDNA не се препорачува освен во клинички испитувања. ctDNA може да се користи и за проценка на мали преостанати лезии по радикална операција на туморот. Тестирањето на ctDNA по операцијата е силен предиктор за последователна прогресија на болеста и може да помогне да се утврди дали пациентот ќе има корист од адјувантна хемотерапија, но сепак не се препорачува употреба на ctDNA надвор од клиничките испитувања за насочување на одлуките за адјувантна хемотерапија.

Обработка на податоци Првиот чекор во секвенционирањето на геномот е да се екстрахира ДНК од примероци од пациенти, да се подготват библиотеки и да се генерираат сурови податоци за секвенционирање. Суровите податоци бараат понатамошна обработка, вклучувајќи филтрирање на податоци со низок квалитет, споредување со референтниот геном, идентификување на различни видови мутации преку различни аналитички алгоритми, одредување на ефектот на овие мутации врз транслацијата на протеините и филтрирање на мутациите на герминативната линија.
Анотацијата на генот-драјвер е дизајнирана да ги разликува мутациите на генот-драјвер и патничкиот. Мутациите-драјвер водат до губење или зголемување на активноста на генот-супресор на туморот. Малите варијанти што водат до инактивација на гените-супресор на туморот вклучуваат бесмислени мутации, мутации на поместување на рамката и мутации на местото на спојување на клучот, како и поретко делеција на старт кодон, делеција на стоп кодон и широк спектар на мутации на вметнување/бришење на интрон. Покрај тоа, мутациите на мисенс и малите мутации на вметнување/бришење на интрон, исто така, можат да доведат до губење на активноста на генот-супресор на туморот кога влијаат на важни функционални домени. Структурните варијанти што водат до губење на активноста на генот-супресор на туморот вклучуваат делумно или целосно делеција на генот и други геномски варијанти што водат до уништување на рамката за читање на генот. Малите варијанти што водат до подобрена функција на онкогените вклучуваат мутации на мисенс и повремени вметнувања/бришења на интрони што се насочени кон важни функционални домени на протеините. Во ретки случаи, мутациите на скратувањето на протеините или местото на спојување може да доведат до активирање на онкогените. Структурните варијации што водат до активирање на онкогените вклучуваат фузија на гени, делеција на гени и дупликација на гени.
Клиничкото толкување на геномските варијации ја проценува клиничката значајност на идентификуваните мутации, т.е. нивната потенцијална дијагностичка, прогностичка или терапевтска вредност. Постојат неколку системи за оценување базирани на докази кои можат да се користат за водење на клиничкото толкување на геномските варијации.
Базата на податоци за онкологија на прецизната медицина (OncoKB) на Центарот за рак „Меморијал Слоун-Кетеринг“ ги класифицира генските варијанти на четири нивоа врз основа на нивната предикативна вредност за употреба на лекови: Ниво 1/2, одобрени од FDA или клинички стандардни биомаркери кои го предвидуваат одговорот на специфична индикација на одобрен лек; Ниво 3, одобрени од FDA или неодобрени биомаркери кои го предвидуваат одговорот на нови целни лекови кои покажале ветување во клиничките испитувања и Ниво 4, неодобрени од FDA биомаркери кои го предвидуваат одговорот на нови целни лекови кои покажале убедливи биолошки докази во клиничките испитувања. Додадена е петта подгрупа поврзана со отпорност на третман.
Упатствата на Американското здружение за молекуларна патологија (AMP)/Американското здружение за клиничка онкологија (ASCO)/Колеџот на американски патолози (CAP) за толкување на соматските варијации ги делат соматските варијации во четири категории: Степен I, со силно клиничко значење; Степен II, со потенцијално клиничко значење; Степен III, клиничко значење непознато; Степен IV, за кој не е познато дали е клинички значаен. Само варијантите од степен I и II се вредни за одлуките за третман.
Скалата за клиничка операбилност на молекуларна цел (ESCAT) на ESMO ги класифицира генските варијанти на шест нивоа: Ниво I, цели погодни за рутинска употреба; Фаза II, цел која сè уште се изучува, веројатно ќе се користи за скрининг на популацијата на пациенти кои би можеле да имаат корист од целниот лек, но потребни се повеќе податоци за да се поддржи тоа. Степен III, целни генски варијанти кои покажале клиничка корист кај други видови рак; Степен IV, само целни генски варијанти поткрепени со претклинички докази; Во степен V, постојат докази кои ја поддржуваат клиничката значајност на таргетирањето на мутацијата, но терапијата со еден лек против целта не го продолжува преживувањето или може да се усвои стратегија за комбиниран третман; Степен X, недостаток на клиничка вредност.